Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠快速制備及電泳試劑盒（含預(yù)染Marker）

Ver.750270-2.0

● 產(chǎn)品組成：

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

該產(chǎn)品含有多肽電泳全套試劑，可以用來檢測(cè)1-20 kD的多肽大小。本試劑盒可配制至少10塊常規(guī)大?。?×10cm）,厚度1 mm的PAGE膠。該產(chǎn)品具有以下特點(diǎn)：

1. 分辨率高：凝膠緩沖液獨(dú)特配方，可以有效分離1-5 kD多肽；

2. 使用方便：制膠無需計(jì)算所需溶液量；無需制備三層凝膠（濃縮膠，夾層膠，分離膠）；

3. 配套 Tris-Tricine-SDS緩沖液，無需區(qū)分陽(yáng)極緩沖液和陰極緩沖液;

4. 試劑盒配套有預(yù)染蛋白Marker，方便檢測(cè)多肽大小；

5. 試劑盒配套有快速蛋白染色液，最快可以在30分鐘內(nèi)完成染色過程，有效避免小肽從凝膠中游離。

● 貯存、運(yùn)輸及效期：

按照標(biāo)簽溫度貯存；濕冰運(yùn)輸；有效期一年。

● 使用說明：

一. 制膠：

10%APS溶液配制：

10% APS為固體粉末，使用前加入5 ml雙蒸水溶解即配制成10% APS溶液，將溶液分裝后置于-20℃保存，通常一年內(nèi)有效。該溶液在4℃條件下可以穩(wěn)定保存兩周。若發(fā)現(xiàn)凝膠聚合時(shí)間延長(zhǎng)，應(yīng)考慮更換使用-20℃保存的10% APS溶液。

1.1 配制分離膠:

1.1.1按照表一將不同體積的成分加入到小燒杯中混合；立即混勻5-10秒，以使溶液充分混勻。                   

表1 （一塊厚度1 mm 8×10cm凝膠膠用量）*

注： * 如非必須，不要使用厚度1.5 mm的凝膠，盡量使用厚度1 mm的凝膠，這樣會(huì)減少電泳后染色和脫色的時(shí)間。

1.1.2 在玻璃板中迅速灌入適量分離膠溶液，使液面和短玻璃板上沿之間的距離比梳齒長(zhǎng)0.5 cm即可。注：此溶液為過量，請(qǐng)勿全部注入。

1.1.3 然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-2 cm的無水乙醇層，使凝膠表面保持平整。

1.1.4 靜置10-30分鐘，待分離膠和乙醇層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面表示凝膠已聚合。

注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)?？梢愿鶕?jù)表1的標(biāo)準(zhǔn)條件調(diào)節(jié)促凝劑的加入量。分離膠在25℃條件下，約20分鐘可以聚合。

1.2 配制濃縮膠:

去除覆蓋在分離膠上的乙醇層，用濾紙將殘留的乙醇吸去。

1.2.1 按照表一將不同成分加入到小燒杯中混合；立即混勻5-10秒，以使溶液充分混勻。

1.2.2 將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。

1.2.3 靜置30-50分鐘待凝膠聚合。

注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)?？梢愿鶕?jù)表1的標(biāo)準(zhǔn)條件調(diào)節(jié)促凝劑的加入量。濃縮膠在25℃條件下，約40分鐘可以聚合。

二. 電泳：

2.1 變性電泳緩沖液和樣品配制：

2.1.1 10×Tris-Tricine- SDS緩沖液配制：

將10×Tris-Tricine-SDS緩沖液（10×TTS）粉末（Cat：CB010P）置于一干凈的燒杯中，加入500 ml超純水，徹底攪拌混勻，不要調(diào)節(jié)pH，即配成500 ml 10×緩沖液。超純水稀釋10倍配成1×Tris-Tricine-SDS緩沖液。

2.1.2 變性樣品處理：

        待上樣的檢測(cè)樣品與2×Tricine上樣緩沖液（變性，還原，含溴酚藍(lán)）[Cat No：TP080]等體積混合，95℃處理5分鐘后上樣。蛋白Marker一般已經(jīng)含有上樣緩沖液，根據(jù)說明書上樣（預(yù)染Marker不能加熱處理，非預(yù)染Marker上樣前一般要95℃處理5分鐘）。試劑盒配套的預(yù)染Marker（Cat：RTD6148）不要加熱處理，溶化混勻后直接上樣，1 mm厚度10齒梳子建議上樣3-5 μl。

2.2 電泳：

將電泳槽的內(nèi)槽加滿電泳緩沖液，輕柔拔出梳子，用1 ml移液器將梳孔吹洗干凈，將Marker或蛋白樣品加入點(diǎn)樣孔，穩(wěn)壓電泳（表2），至溴酚藍(lán)指示前沿至分離膠下沿位置時(shí)即可停止電泳。整個(gè)電泳過程大約需要2.5-3個(gè)小時(shí)。

表2 多肽電泳條件（單板電泳）

三. 染色：

3.1將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中,用適量蒸餾水漂洗，去除膠表面的SDS，殘余SDS會(huì)導(dǎo)致染色液出現(xiàn)沉淀。

3.2 棄蒸餾水，加入適量染色液（以剛剛覆蓋過膠面為適)，搖床上常溫?fù)u動(dòng)，根據(jù)下表確定染色時(shí)間。

3. 3 搖床上搖動(dòng)至所有條帶清晰可見。

3. 4 蒸餾水搖動(dòng)漂洗脫色1-2次，每次5-10分鐘，至凝膠背景干凈。

3. 5 收集用過的染色液，可以重復(fù)使用2-3次。

凝膠也可以使用常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色液和脫色液進(jìn)行染色和觀察。需要注意的是，常規(guī)染色和脫色方法需要較長(zhǎng)時(shí)間，小肽由于長(zhǎng)度較短，和凝膠結(jié)合不緊密，長(zhǎng)時(shí)間在溶液中浸泡容易從凝膠中脫離。FastBlue蛋白染色液除具有染色快，無毒，靈敏性高等特點(diǎn)外，還能對(duì)小肽在染色中起到固定作用，不至于小肽在染色和脫色中從凝膠中脫離，是常規(guī)染色液的理想替代品。

四. 轉(zhuǎn)膜：

多肽轉(zhuǎn)膜選擇孔徑0.22 μm PVDF膜（用前用甲醇處理潤(rùn)濕）或0.22 μm NC膜。

4.1 半干轉(zhuǎn)：

使用伯樂Trans-Blot Turbo半干轉(zhuǎn)機(jī)器請(qǐng)選擇配套的5×RealBlot快速半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號(hào)：RT5030）。轉(zhuǎn)膜推薦條件：一板小型凝膠（8×10 cm）恒流，1.3 A，7-10 min。

4.2 濕轉(zhuǎn)：

濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜緩沖液（25 mM Tris,192 mM Glycine, 0.01%SDS，20% Methanol,pH~8.3），可以選擇10×Tris-甘氨酸轉(zhuǎn)膜緩沖液（濕轉(zhuǎn)，溶液型）（貨號(hào)：TB1040）。轉(zhuǎn)膜條件：恒流200 mA  40-60 min。

五. 實(shí)驗(yàn)示例：

多肽電泳配套試劑